与不同胶质母细胞瘤分子亚型相关的免疫景观
ActaNeuropathologicaCommunications
IF：6.3
Publishedin.11.29
Introduction
最近的研究突出了肿瘤微环境在癌症中的核心作用。特别是，肿瘤和免疫细胞之间的相互作用可能有助于推动脑肿瘤的发展，如多形性胶质母细胞瘤(GBM)。尽管对胶质母细胞瘤的分子分类有重要的研究，但很少有研究全面地描述免疫原位浸润和不同胶质母细胞瘤亚型。
大多数关于癌症免疫状况的综合分析，包括胶质母细胞瘤的分析，都依赖于大数据集的RNA表达分析，即TCGA。虽然这为理解癌症的免疫成分奠定了基础，但这些硅方法没有考虑每个肿瘤中免疫细胞的分布、定位或比例差异。为了解决这个问题，我们建立了组织微阵列，旨在全面检查GBM微环境中的免疫细胞组成。
Result01GBMTMAs免疫标记的数字图像分析表1
我们纳入了98例GBM患者的原发肿瘤，这些肿瘤是在最初的手术中获得的。这些样本之前已经被纳入了使用亚型特异性表达模式的GBM亚型队列研究。本队列GBM亚型分布如下:古典型24.5%，间质型26.5%，神经型22.5%，神经前型26.5%(表1)。
免疫组化(IHC)检测的IDH1RH突变极为罕见，仅4.1%的病例存在。对于每个病例，都检查了HE染色玻片，并选择不同组织学的代表性区域，以解释GBM样本中观察到的异质性，TMAs中包含的每个肿瘤最多有6个核。
图1
为了进行无偏分析，我们使用了数字图像分析方法(图1)。首先，我们评估了DAB染色剂的光谱特性，然后我们训练软件识别肿瘤和非肿瘤区域。我们排除了血管腔内区域和坏死区域。
接下来，我们通过训练算法进行细胞分割来识别独特的细胞类型。我们使用训练过的算法根据DAB信号光谱特性识别和评分免疫浸润细胞，从而避免了研究者的偏见，并提供了比传统方法更高的准确性和精度。
02GBM免疫景观的异质性图2
在对GBM的生物学理解上的一个主要差距是对这些肿瘤的细胞和分子异质性的彻底描述。这种异质性也影响治疗的发展。因此，为了获得更全面的GBM免疫景观视图，我们在每个肿瘤获得的所有切片上使用了几个核心。每个核的选择最多代表所观察到的组织学异质性。在我们的队列中，大多数病例的特征是不同免疫细胞的异质浸润。
然后我们应用半定量的方法来定义在同一患者不同核心免疫浸润的异质性。对于每个患者，我们计算每个免疫标记在核心之间的比率，然后取平均值。结果的比例绘制在热图上，比例断点为1、2、4、8和16，显示颜色饱和度从白色增加到红色(图2)。
肿瘤内免疫异质性水平与特异性免疫人群或特异性GBM亚型无关。有趣的是，我们观察到一些样本明显比其他样本更具异质性(图2和图3)。例如，GBM#31在不同核间大多数免疫细胞类型的百分比(6/7)有显著差异(图2)，而其他肿瘤如GBM#23仅1/7种免疫细胞类型存在核间异质性(图2)。
目测也可提示在亚型中可能存在具有相似异质性水平的样本子群。虽然本分析在核心选择上存在一定的偏倚，但很明显，GBM免疫景观的异质性存在显著差异。
03胶质母细胞瘤包含少量B细胞，而T细胞的百分比因亚型而异图3
为了确定浸润性T淋巴细胞的水平，我们比较了所有GBM样本中CD3+和CD5+细胞的百分比。免疫组化显示血管周围和这些细胞亚群的浸润性分布(图3)，这两种模式都出现在大多数核心有血管的情况下。
图4
尽管样本间存在差异，但总体而言，间充质亚型的T细胞浸润量最高，CD3+(0.77%±0.63)和CD5+(1.31%±1.27)。CD3+细胞的百分比在间叶型和神经前型之间有显著差异(0.32%±0.31,p=0.)，在间叶型和经典型之间有显著差异(0.57%±0.44,p=0.03)，但其他亚组间无显著差异(图4)。这与四种不同类型的CD5+浸润T细胞相平行:间充质型和神经前型之间(0.34%±0.35,p=0.)以及间充质型和经典型之间(0.67%±0.70,p=0.)存在显著差异。
图5
此外，在T细胞群中，与经典型(0.24%±0.23,p=0.)和神经前型(0.20%±0.18,p=0.)相比，间充质型(0.58±0.59)CD4+细胞的比例也更高(图5)。令人惊讶的是，在4种GBM亚型中，CD8+浸润细胞的百分比(占肿瘤面积的0.18%~0.38%)未见差异(图5)。
虽然需要注意的是淋巴细胞在肿瘤细胞总数中所占的比例非常低(一般小于5%)，但我们发现间质GBMs中T细胞浸润最多。
04巨噬细胞和小胶质细胞造成了GBM亚型之间的差异图6
在我们研究的免疫细胞类型中，巨噬细胞和小胶质细胞是每一种GBM亚型的主要群体。在某些病例中，它们占肿瘤中所有细胞的80%以上(图6)。与其他类型的细胞一样，定量分析也显示在被检查的样本之间和样本内部有很大的异质性。
在GBM各亚型中，CD+细胞最丰富，但间质细胞(78.94%±24.41)明显多于经典细胞(43.02%±45.79)，p0.;vs神经前(25.44%±26.26)，p=0.;与神经(43.02%±45.79),p=0.))(图6)。CD68+细胞在间质GBMs中也最为丰富，其比例(23.75%±19.55)与经典GBMs(10.21%±3.16,p=0.)和神经前GBMs(7.60±3.86%，p=0.0)显著不同(图6)。
巨噬细胞和小胶质细胞浸润量次之的亚型为神经亚型。虽然CD+巨噬细胞在神经亚型和神经前亚型之间的百分比差异无统计学意义，但CD68+小胶质细胞在神经亚型(14.22±13.60)和神经前亚型(7.60±3.86)之间的百分比差异有统计学意义(p=0.)(图6)。
因此，总的来说，我们发现间叶细胞型胶质母细胞瘤中肿瘤浸润的巨噬细胞和小胶质细胞的比例显著高于经典亚型和前神经亚型，其次是神经亚型中肿瘤浸润的小胶质细胞的比例更高。
05TCGA数据显示不同亚型的免疫细胞组成存在显著差异图7
为了补充和验证我们在单机构队列中观察到的结果是否可以从整体上推断GBM亚型，我们将我们的结果与TCGAGBM肿瘤中免疫细胞类型浸润的相对组成进行了比较(n=)。
我们将ssGSEA按基因表达为基础的亚型分层，评估TCGAGBMs中CD4+、CD8+和巨噬细胞免疫细胞系的相对富集。我们将ssGSEA经验累积分布函数(eCDF)与我们GBM数据集中阳性百分比测量的细胞相对数量进行了比较(图7)。
为了确定结果的重要性,我们三个单向方差分析(方差分析)模型比较ssGSEA分数CD4、CD8,巨噬细胞细胞类型标记,都是非常重要的(分别是p=2×10?16,p=6.28×10?15和p=2×10?16)。
为了进行亚型特异性比较，我们对TCGAGBM亚型ssGSEA富集评分进行两两t检验。通过错误发现率(falsediscoveryrate,FDR)对计算的p值进行调整(图7)。巨噬细胞是免疫细胞浸润的主要成分，其中间充质GBMs中巨噬细胞含量最高(均p0.0)，其次是神经型(均p0.05)、经典型(均p0.05)和神经前型GBMs(均p0.0)。
在我们的免疫组化分析中，CD4+和CD8+T细胞的分布遵循相同的趋势，其中间充质亚型的浸润程度最高(均p0.0)。
总之，我们的免疫组化结果得到了外部队列和不同方法的验证，表明在4种GBM亚型中，间充质亚型往往具有最高的免疫细胞含量，而经典GBM似乎不太有利于整体免疫细胞浸润。
06不同的免疫内容和联系到GBM的生存为了确定GBM免疫含量是否与生存相关，我们在Kaplan-Meier曲线上绘制了免疫细胞百分比的结果(根据每个细胞标记物的百分比，患者被平均分为三组，即低、中、高)(图8)。
在检测的免疫人群中，唯一发现与患者生存显著相关的是CD+巨噬细胞谱系。CD+细胞百分比中、高水平确实与较差的预后相关(p=0.28)。有趣的是，在这两种情况下，中等水平的巨噬细胞浸润对患者生存的影响比高水平的更糟。
但是需要注意的是，当我们将年龄、性别和亚型作为协变量进行cox回归模型时，CD没有显著影响，p值为0.。
Conclusion总之，我们的研究是首次对四种GBM亚型的免疫浸润进行详尽的免疫组化研究。我们发现，不同亚型GBM的免疫浸润存在明显差异，这通过外部队列的基因表达分析得到了验证。这为肿瘤间免疫细胞异质性提供了新的见解。虽然我们只发现了一种与生存相关的标记物，但更大规模的研究可能能够确定一种“免疫评分”，该评分可用于预测疾病进展和治疗反应。
Rreference：Immunelandscapesassociatedwithdifferentglioblastomamolecularsubtypes
PMID：
DOI：10./s---6
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