胶质母细胞瘤亚型的免疫微环境

Frontiersinimmunology

IF：4.

Publishedin.5.18

Introduction

胶质母细胞瘤（GBMs）是最常见的侵袭性的原发性脑肿瘤。由于GBMs的恶性进展、入侵脑实质以及对治疗的抗性，所以它是所有癌症中最致命的。GBMs在分子和组织学水平上具有高度异质性。组织学结构特点包括假性闭塞性坏死和微血管增生。除了高水平的瘤内异质性，GBMs也表现出高水平的肿瘤间异质性。GBMs中主要的非肿瘤细胞群包括先天性免疫细胞系统，称作肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）。来自文献的相关数据表明，分子上不同的GBMs亚型表现出微环境的差异。GBMs的小鼠模型数据表明基因驱动突变可以创造独特的微环境。

胶质母细胞瘤（GBMs）是最常见的侵袭性的原发性脑肿瘤。由于GBMs的恶性进展、入侵脑实质以及对治疗的抗性，所以它是所有癌症中最致命的。GBMs在分子和组织学水平上具有高度异质性。组织学结构特点包括假性闭塞性坏死和微血管增生。除了高水平的瘤内异质性，GBMs也表现出高水平的肿瘤间异质性。GBMs中主要的非肿瘤细胞群包括先天性免疫细胞系统，称作肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）。来自文献的相关数据表明，分子上不同的GBMs亚型表现出微环境的差异。GBMs的小鼠模型数据表明基因驱动突变可以创造独特的微环境。

由于TAM肿瘤发展的贡献是很大的,利用TCGA和GEO数据库的基因表达数据进行的几项研究表明，与其他亚型相比，GBMMES（间充质干细胞）亚型中与免疫应答相关的基因表达，特别是TAM基因的表达更为丰富,这表明TAMs可能在GBM中发挥亚型特异性的作用。尽管广泛的相关研究和体外实验表明TAMs可能在GBM亚型中发挥不同的作用，但到目前为止，仍没有系统功能研究证实这一假设。相反，尽管来自小鼠模型和hGBM的TCGA分析的证据表明NF1缺陷导致TAM浸润增加，但这一发现的临床意义并不明显。

在临床上，这些亚型还没有被确定为生存的预测生物标志物，尽管不断积累的临床前证据表明，亚型特异性治疗可能优先有利于患者。然而，目前还不清楚是什么控制了GBM亚型中免疫成分的差异。一种情况是，由基因突变驱动的肿瘤相关或肿瘤特异性抗原在不同亚型中以不同的方式呈现，从而形成各种分子免疫反应，并导致观察到的免疫细胞的差异积累。

胶质母细胞瘤创造了一个促血管生成和炎症的微环境，导致内皮细胞粘附分子表达增加，紧密连接减少，从而形成高渗透性血脑屏障(BBB)。这些变化支持白细胞通过外渗脑内皮壁从血流中流出并浸润肿瘤团块。

除了TAMs，许多其他的免疫细胞也在GBM实质中发现，尽管发病率低得多。T细胞可能占GBM淋巴样细胞的大部分;然而，通过流式细胞术检测，从hGBM活检样本中分离出的肿瘤细胞不到0.25%。CD8+细胞毒性T细胞是杀伤肿瘤细胞所必需的细胞免疫效应细胞，但在GBM实质中仅稀疏分布，占CD3+T细胞总数的不到四分之一。这些来自GBM患者的T细胞对体外直接抗CD3刺激的反应低于来自健康对照的细胞，表明免疫抑制状态。

为了支持这一观点，最近有研究表明gbm浸润的T细胞增加了其吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1)的表达，这是一种免疫抑制受体，并且这种高表达与不良预后相关。目前，一项I期临床试验正在研究IDO1抑制剂联合TMZ治疗儿童原发性恶性脑肿瘤的安全性和实用性。调节性T细胞(Treg)也存在于GBM实质中。这些细胞具有免疫抑制功能，并被认为在各种实体肿瘤如卵巢癌、乳腺癌和胰腺癌中抑制抗肿瘤免疫。在GBM肿瘤细胞中，分泌的可溶性因子，包括CCL22，可以促进肿瘤微环境中Treg的募集和保留，Treg的数量与患者的生存呈负相关，但没有统计学意义。Treg消融可以消除T细胞增殖缺陷，使GBM患者的T细胞功能在体外恢复到与健康对照组相当的水平。因此，靶向Treg可以潜在地逆转肿瘤免疫逃避，从而促进肿瘤免疫治疗或常规治疗。

对人类PN、CL和MES样本中的22种免疫细胞类型的硅估计表明，与非MES肿瘤相比，MES肿瘤中的几种细胞类型有集体增加，包括CD4+记忆T细胞、2型极化巨噬细胞和中性粒细胞。据推测，较高水平的TAM可能阻碍效应T细胞的浸润，因为TAM具有免疫抑制功能。然而，TAMs和T细胞以亚型特异性方式同步浸润的原因并不明显。这可能是因为当血脑屏障在GBM发育过程中受损时，T细胞跟随TAMs被动地排出血液。然而，这是不太可能的，因为肿瘤中的T细胞与TAMs的比例与血液中的不同，血液中的淋巴细胞的数量大大超过单核细胞(肿瘤TAMs的祖细胞)。一种可能的解释是，与其他GBM亚型相比，在分别吸引TAMs和T细胞的MES肿瘤中，CCL趋化因子(吸引单核细胞)和CXCL趋化因子(吸引淋巴样细胞)平行增加。

基因工程小鼠模型(GEMMs)再现了hGBM亚型，是研究亚型特异性免疫病理和设计相关有效治疗方法的宝贵工具。这些特异性的GEMMs为确定免疫细胞和分子信号提供了前所未有的机会，这些细胞和分子信号有助于胶质瘤的发生，并通过亚型特异性胶质瘤微环境促进持续生长。对于关于肿瘤-微环境相互作用的具体问题，与其他模型相比，用于各种GBM亚型的GEMMs代表了更好的选择，如利用已建立的鼠GBM细胞系，在血清中培养多年，或hGBM异种移植，其中有众所周知的物种不相容，特别是趋化因子及其受体。这些模型的所有可取的特性之一是，它们利用免疫活性小鼠，其中免疫细胞和肿瘤细胞是同一物种，消除了趋化因子、细胞因子、它们各自的受体对于招募和激活各种免疫细胞类型都很重要。GBM的GEMM模型将使我们能够回答有关不同hGBM亚型中差异免疫浸润相关性的重要生物学问题。

肿瘤相关巨噬细胞来源于两个独立的来源:脑驻留的小胶质细胞和/或骨髓来源的单核细胞(图1A)。小胶质细胞是中枢神经系统(CNS)特有的常驻巨噬细胞。命运定位和谱系追踪研究发现，未成熟卵黄囊runt相关转录因子1(Runx1)阳性祖细胞是脑小胶质细胞的主要来源。在胚胎期8.5(E8.5)到E9.5期间，这些祖细胞从卵黄囊迁移到原始大脑，在那里它们作为小胶质细胞的起源细胞。

随后的几项研究在小鼠身上发现，出生后血液中的髓系祖细胞对成年小胶质细胞池没有显著贡献。因此，大多数成年小胶质细胞是卵黄囊衍生的，并通过其寿命和有限的自我更新来维持。通过小鼠长期体内单细胞成像追踪小胶质细胞的寿命，发现新皮层驻留小胶质细胞平均寿命约为15个月，几乎可以与有丝分裂后神经元的寿命相媲美。虽然na?ve中枢神经实质完全被驻留的小胶质细胞所占据，但承载肿瘤的中枢神经系统却有很大的不同。

在携带肿瘤的大脑中，血脑屏障受损，单核细胞趋化蛋白家族(MCPs)的表达增加。这导致单核细胞从外周渗入肿瘤，并在那里分化为巨噬细胞。单核细胞来源于称为巨噬细胞-DC前体的子代，巨噬细胞来源于造血干细胞。这些前体在骨髓中分化为单核细胞，随后释放到血液循环中，在周围器官定植。

小鼠单核细胞可以进一步细分为两个主要群体:Ly6C+、CX3CR1int和CCR2+炎性单核细胞;以及Ly6C?、CX3CR1hi和CCR2?循环单核细胞。已经证实Ly6C+，CX3CR1int和CCR2+炎症单核细胞离开血液循环并渗出到炎症组织。一旦回到炎症组织，这些细胞在分化为巨噬细胞时，会逐渐下调它们的CCR2，同时上调CX3CR1。有趣的是，TAMs表现出广泛的CX3CR1和CCR2的相互表达水平(即降低CCR2和增加CX3CR1)，表明这些细胞从单核细胞浸润到成熟的巨噬细胞的持续转化。这种表面分子的动态转变表明，骨髓来源的单核细胞具有高度可塑性，这些细胞在肿瘤定位后在原位进化成熟。

已经证实，骨髓来源的巨噬细胞和小胶质细胞对各种类型的中枢神经系统损伤有不同的反应，并能执行不同的功能。最近一项使用复杂异种共生模型的研究表明，在实验性自身免疫性脑脊髓炎中，外周单核细胞侵袭炎症的中枢神经系统，并在疾病进展至瘫痪中发挥重要作用。通过使用上述pdgfb驱动的GBM的gem，我们最近发现绝大多数(高达85%)的TAMs浸润骨髓来源的单核/巨噬细胞，而驻留的小胶质细胞占其余的~15%。骨髓源性细胞主要分布在血管周围区域，而小胶质细胞在肿瘤周围区域高表达(图(图1B)。

RNA测序分析显示，骨髓源性TAMs和小胶质细胞源性TAMs的功能区别在于，前者中与“细胞迁移”相关的基因主要富集，而后者中与“促炎细胞因子”和“代谢”相关的基因上调。这些差异的部分原因可能是这两个细胞群来自不同的祖细胞，选择性地使用不同的转录因子进行基因调控。为了进一步说明它们的功能差异，我们从PDGFB胶质瘤小鼠微环境中基因删除Cx3cr1，发现与野生型Cx3cr1相比，Cx3cr1缺失的间质肿瘤发生率增加，生存时间缩短。

这些结果表明Cx3cr1的丢失间接促进了炎性单核细胞向中枢神经系统的运输，导致血管周围区域的高积累。然而，它并不直接影响瘤周区域小胶质细胞的积累。骨髓来源的单核细胞通过IL-1β的产生促进胶质瘤干细胞样细胞的增殖。这些数据有力地表明，来自骨髓腔室的TAMs驱动胶质瘤的发生，而小胶质细胞似乎在肿瘤生长中发挥不那么重要的作用，主要参与肿瘤细胞的侵袭。

总的来说，这些观察结果导致了几个突出的问题:(a)与PN亚型相比，人类和小鼠MESGBM均表现出更强的TAM浸润，但他们表现出不同的TAM成分吗?(b)TAMs的数量或成分对促进肿瘤发展更重要吗?(c)TAMs在CL亚型中有何不同?此外，TAM的起源对它与T细胞的相互作用重要吗?这些都是非常重要的问题，将提供新的见解，可以用于设计成功的免疫疗法，旨在杀死肿瘤细胞。

肿瘤相关的巨噬细胞由于其促血管生成和免疫抑制的特性，通常被认为是肿瘤生长的促进剂。在这些细胞中，有一些被称为骨髓源性抑制细胞(MDSCs)。广义上，小鼠的MDSCs是同时表达CD11b和Gr1表面标记物的细胞，它们可以进一步细分为单核细胞和粒细胞亚型。在GBM中，粒细胞性MDSCs在肿瘤中很少发现。单核细胞MDSCs可以采用多种机制抑制细胞免疫功能，包括上调Arg1的产生、诱导t细胞凋亡和/或增强Treg群体的扩张。所有这些特征都与M2表型一致。体外研究初步证实了巨噬细胞的二分分化，如髓系单核细胞可以极化为经典激活、促炎症(M1)或交替激活、抗炎(M2)表型。M1细胞产生高水平的氧化代谢物和促炎细胞因子，这对宿主防御是必要的，但也可以导致健康的组织损伤。另一方面，M2细胞促进伤口愈合，抑制不良免疫反应。

然而，尽管这些最初的发现在细胞培养实验中，M1和M2二元绝对分布是罕见的在体内。随后，人们提出了一系列分化，其中M1和M2表型位于谱系的末端。事实上，在我们对纯化的肿瘤相关小胶质细胞和骨髓源性巨噬细胞的转录组分析中，我们发现在两个TAM群体中M1和M2表型的混合群体(图2)。例如，典型的M2标记物Arginase1在骨髓源性巨噬细胞和小胶质细胞中均上调了10倍(log2尺度)，而特异性M1细胞因子IL-1β在两种细胞类型中也上调了5倍。然而，目前尚不清楚这些M1和M2分子签名是否属于不同的群体，或者单个细胞是否可以以不同的强度表达这两组分子。清楚的是，TAMs具有高度可塑性，并已被发现在M1和M2表型之间转换，以响应它们的环境线索。许多人试图将TAMs与M1的命运极化;然而，持续转化仍然是一个重大挑战，因为尽管有药物或遗传干预，肿瘤细胞产生的可溶性因子可以将TAMs转变为M2表型。对协调这种转化的分子网络的全面了解将有助于未来维持长期抗肿瘤表型的尝试。

考虑到TAMs是肿瘤发展的基本同谋，基于抑制其浸润或促进其死亡的治疗方案是合理的。MCPs在介导单核细胞迁移和组织浸润中发挥重要作用。人类有4个MCP家族成员-CCL2,CCL7,CCL8和CCL13，而小鼠表达CCL2,CCL7,CCL8和CCL12。在小鼠GBM中，我们发现GBM中的肿瘤细胞表达高水平的CCL2，这有助于CCR2Hi炎症单核细胞向肿瘤的定向浸润。当我们查询人类TCGA数据库中CCL2表达情况，并将患者分为CCL2高表达和低表达队列时，我们发现CCL2低表达的GBM患者比CCL2高表达的GBM患者存活时间明显更长。这些发现提出了一个问题，即通过靶向CCL2-CCR2轴减少单核细胞浸润是否是治疗小鼠PDGFB-GBM的可行选择，考虑到该亚型中80%的TAMs都来自单核细胞。

为了解决这个问题，我们发现在基因上中断CCL2-CCR2轴可以延长带GBM小鼠的存活时间，这与之前的药理学研究一致。然而，与有希望的临床前研究相比，用于转移性实体肿瘤患者的抗CCL2的中和性单克隆抗体并没有产生良好的结果。虽然临床上没有对GBM采用类似的治疗方法，但如果考虑采用这种方法，应谨慎，因为不同GBM亚型浸润性TAMs的成分不同。低水平骨髓源性TAMs的肿瘤可能对这种治疗无效。这一临界点也反映在抗VEGFA抗体与RT联合时仅在PN亚型中起作用，而在其他GBM亚型中不起作用。

小胶质细胞依赖集落刺激因子1(CSF-1)存活，CSF-1受体抑制剂可以有效消除na?ve小鼠大脑中的小胶质细胞。尽管药物活性化合物在临床前动物研究中对PNGBM的GEMM表现出了极好的疗效，但它们并不能成功地消除或减少GBM中的TAM数量，这表明TAM获得了CSF-1独立性。然而，一种CSF-1受体抑制剂未能在非分层复发GBM患者中提供临床益处。翻译的失败很可能是因为TAM的异质性没有得到充分的解决，并且仍然缺乏如上所述关于它们的不同组成和功能的知识。这也可能表明CSF-1在人类和小鼠中的不同作用。为了开发有效的治疗方法，我们必须了解TAMs在GBM个别亚型中的独特功能。纯化群体的RNA-seq分析可以为了解肿瘤发展的病理生物学属性以及亚型特异性差异提供见解。

如上所述，TAMs具有高度可塑性，并保持在致瘤M1和致瘤M2表型之间切换的能力。政府已努力使助教接受“再教育”，使他们向M1方向发展。例如，纳米粒子可以有效地穿透实体肿瘤并在局部释放药物。IL-12是一种极化th1的细胞因子，携带的纳米颗粒可以促进TAMs从M2向M1的逆转。进一步研究表明，肿瘤内传递表达IL-12的溶瘤病毒，同时全身注射抗CTLA-4和抗PD-1抗体，可以显著延长带GBM小鼠的存活时间。这种有益作用主要归因于治疗时TAMs的M1极化。然而，有趣的是，CD4T细胞的消耗可以消除这种治疗效果，呈现出TAMs和CD4T辅助细胞之间以前未被重视的联系，以及肿瘤死亡。

肿瘤免疫治疗的最新进展使人们对有效治疗GBM产生了极大的热情和期待。然而，目前大多数的癌症免疫疗法都专注于细胞毒性T细胞的重要性。这可能低估了先天免疫成分在肿瘤微环境中的重要性，如TAMs。肿瘤具有高度的适应性，并保持大量的非肿瘤细胞;因此，应该考虑同时靶向肿瘤细胞、TAMs和T细胞的多个方面的联合治疗。在这方面，研究表明阻断TAM介导的免疫抑制对提高基因治疗介导的GBM免疫治疗的疗效有很大的希望。此外，考虑到GBM亚型之间在分子信号、TAM成分和t细胞丰度方面的显著差异，考虑亚型特异性的联合治疗可能会为未来GBM免疫治疗带来更大的成功。

Rreference：ImmuneMicroenvironmentinGlioblastomaSubtypes

PMID：

DOI：10./fimmu..

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